近年來，歐鰻的大規(guī)模集約化養(yǎng)殖已在我國日益增多。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖密度的不斷提高，各種影響歐鰻成活率的問題也日漸增多，而由嗜水氣單胞菌作為病原的歐鰻暴發(fā)性傳染病則是其中一個突出問題。本文對嗜水氣單胞菌的生理生化特性、致病因子、致病條件等作了一系列的初步研究，旨在為歐鰻暴發(fā)性傳染病的防治提供有力的理論依據(jù)，更好地推動歐鰻養(yǎng)殖業(yè)向著更強、更快、更健康的方向發(fā)展。
一、材料與方法
1.病原菌的分離
采用普通蛋白瓊脂培養(yǎng)基，其成份為胰蛋白胨10g，酵母膏10g，氯化鈉5g，瓊脂18～20g，pH7.2～7.4，15磅20分鐘滅菌備用。
取患典型病癥的鰻魚，以無菌解剖刀將潰爛表層切開，以接種環(huán)迅速挑取少許病灶深層粘液，進行瓊脂平板劃線分離。28℃，24小時常規(guī)培養(yǎng)后，出現(xiàn)一些形態(tài)基本一致的菌落。挑取單菌落，進行純培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接斜面?zhèn)溆谩?nbsp;
2.致病性實驗
將實驗菌種接斜面，28℃培養(yǎng)約24小時，每個斜面中加入無菌生理鹽水5～10mL，制成濃厚菌懸液。取1mL菌懸液，以活菌平板計數(shù)法測定細菌數(shù)，吸取0.1mL菌懸液，注入健康鰻鱺腹腔中（注射前已置水族箱中觀察5天），同時設(shè)對照，置24～28℃水族箱中觀察其癥狀。
3.病原菌的形態(tài)觀察和生理生化實驗
采用致病力較強的菌株Ah3、Ah26、Ah38在28℃條件下，經(jīng)24小時培養(yǎng)，進行革蘭氏染色，鞭毛染色，觀察其形態(tài)及其它生理生化實驗。
4.血清型研究
1）采用小白兔（從市場上購買）制備抗血清。攻毒用健康鰻魚（由養(yǎng)鰻場提供），規(guī)格為40～50g左右，試驗前觀察5～7天證實健康無病。
2）將具有強致病力的Ah3、Ah26、Ah38等菌株分別于營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時，刮取菌苔，用無菌生理鹽水沖洗菌體三次，將菌體分別用0.35%福爾馬林滅活25小時，制得全菌抗原（WC抗原），4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?nbsp;
3）以0.35%福爾馬林滅活體0.1mL（濃度為1×10E9cell/mL）加等量弗氏完全佐劑混合均勻，皮下多點免疫白兔，以后每隔一周耳靜脈加強免疫，并逐次加大抗原劑量，獲滿意效價后頸動脈放血取血清。
4）試管凝聚法：免抗血清（1∶60）稀釋0.25mL，加入0.25mL濃度為15R/mL抗原，充分搖勻，4℃，12小時，觀察其凝聚反應(yīng)。
5.嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測定
Ah菌株接種營養(yǎng)肉湯，28℃培養(yǎng)24小時，測菌濃度，用無菌生理鹽水10倍系列稀釋菌體，腹腔注射健康鰻鱺，實驗水溫25℃，記錄死魚數(shù)及注射菌量，按Reed－Muench法計算LD50。
6.溶血活力測定
將Ah菌株純分離物接種于10%兔血平板，28℃培養(yǎng)過夜，以溶血圈直徑與菌落之比示溶血活力。
7.致病條件的探索性測定
采用致病力較強的Ah38號菌株為攻毒菌株，調(diào)整水族箱內(nèi)水體環(huán)境，使其含菌量大約為5～104cells/mL，在不同條件下，使健康鰻鱺浸浴其中，以觀察嗜水氣單胞菌的條件致病性。
二、實驗結(jié)果
1.本實驗共分離出菌株63株，其中經(jīng)人工感染具有致病力的菌株有8株，在這8株菌中，又有3株菌的致病力是極強的。
2.病原菌的形態(tài)觀察及生理生化特性。
本實驗結(jié)果表明，我們從病魚中就分離到的Ah3、Ah6、Ah7、An26、Ah31、Ah38、 Ah51、Ah53等菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特性及生理生化反應(yīng)基本一致，現(xiàn)以Ah38號菌株為代表簡述如下：
在營養(yǎng)瓊脂平板上，28℃，18～24小時培養(yǎng)菌落圓形、濕潤、表面光滑、低凸，邊緣整齊，半透明，乳白色，直徑1～1.5mm左右，有異味。在肉湯培養(yǎng)基中，28℃，18～24小時培養(yǎng)液均勻混濁，表面呈霧狀薄膜，一搖即散，在高倍顯微鏡下，呈兩端圓形的直桿菌，單個或成對，能運動，無芽胞，無莢膜，革蘭氏染色陰性，電鏡觀察有單生鞭毛。
根據(jù)這些培養(yǎng)特性，我們確認所分離到的菌株屬于嗜水氣單胞菌（Aeromonus hydrophila），它們是引發(fā)歐洲鰻暴發(fā)性傳染病的主要病原，這一點已得到了大多數(shù)學(xué)者的一致公認。
3.我們以致病力實驗中致病能力較強的Ah3、Ah26、Ah38號菌株制備兔抗血清，并與其它5株Ah菌株進行了試管凝聚試驗，結(jié)果表明，Ah3與Ah38屬同一血清型，Ah26屬另一血清型，其余5株分屬這兩個血清型，反應(yīng)專一性強，沒有發(fā)現(xiàn)能同時與兩種血清型反應(yīng)的菌株。
4.嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測定實驗結(jié)果向我們表明，八株Ah菌株對健康鰻鱺均有強的毒力，最強的Ah38號菌株，其LD50低于104CFU，同時，毒力強的菌株其菌溶血圈直徑與菌落直徑之比大于2，表明它有較強的溶血活力，其它LD50較低的菌株其溶血活力也較低。這個實驗結(jié)果啟示我們，嗜水氣單胞菌的毒力與其溶血活力有著一定的線性關(guān)系，不同血清型的菌株其溶血能力不一致，在我們的實驗中，以Ah38號菌株所代表的血清型有著更強的致病力，這為我們今后尋找防治嗜水氣單胞菌感染有效的用生物技術(shù)提供了一個新的思路。
5.嗜水氣單胞菌的條件致病性實驗結(jié)果表明，當(dāng)水體中含有一定量的嗜水氣單胞菌時，假如魚體健康水質(zhì)狀況良好，那么魚感染疾病的幾率是很小的；但當(dāng)魚體本身受到一定的損害時，比如說，腮絲破損或表皮破損，尤其是鰓絲受到損害時，魚則很容易受細菌感染而發(fā)病；而當(dāng)魚體受傷，水體環(huán)境亦差時，魚體的死亡速度和死亡率最高是不言自明的，正如我們的實驗所表示的那樣。
三、討論
嗜水氣單胞菌作為水中的固有菌群，由于它具有宿主范圍廣、感染力強等特點，而成為淡水魚類養(yǎng)殖業(yè)病害的主要病原之一。在實驗中所分離到的具有強致病力的Ah3、Ah26；Ah38號菌株分別代表著兩種不同的血清型，他們組成了引發(fā)江浙滬一帶淡水魚暴發(fā)性傳染病的主要病原；同時，毒力實驗和溶血活力實驗也表明，毒力強的菌株也有著較強的溶血活力。這似乎是嗜水氣單胞桿菌引起魚類大面積潰瘍出血的原因，這個結(jié)果與某些文獻報道結(jié)果基本一致。這些學(xué)者還認為嗜水氣單胞菌能引起魚體出血、溶血和死亡，其產(chǎn)生和溶血素、肉毒素和細胞毒素可能是致病因子有關(guān)。本實驗也表明，不同的菌株其毒性強弱是不同的。我們推測有的菌株只有一種毒性因子，有的則有多種，這與一些學(xué)者的某些觀點是一致的。
關(guān)于嗜水氣單胞菌的侵染途徑，我們初步推測是以腮為主要途徑，侵染后以肝臟為主要增殖部位，繼而再向全身彌漫性擴展，在本次實驗中，我們的致病菌株主要都由肝中分離得到，再感染后也以肝臟中出現(xiàn)病菌時間最早，說明嗜水氣單胞菌感染時還有一定的親嗜性。
氨氮亞硝酸鹽并不能為嗜水氣單胞菌的生長提供營養(yǎng)，但含量過高卻是導(dǎo)致魚類發(fā)病的重要環(huán)境因子。原因在于亞硝酸鹽氮能破壞機體血液的血紅蛋白，使紅血球失去攜氧能力，而氨氮除直接引起魚類中毒以外，還不斷分解產(chǎn)生亞硝酸鹽氮，從而使魚的抗病機能降低，容易受細菌的侵染而生病。在我們的實驗中，氨氮、亞硝酸鹽氮值僅為正常值的兩倍，鰻魚的死亡率即明顯高于對照組，也說明了這點。因此，我們初步認為，嗜水氣單胞菌作為引發(fā)淡水魚類暴發(fā)性傳染病的主要病原，屬于條件致病菌，它的傳染性與魚體的健康狀況和水體環(huán)境有關(guān)。近年來，大量涌現(xiàn)的文獻都報道，嗜水氣單胞菌的耐藥范圍和強度均在不斷拓廣和加強，且藥的殘留已對人類尤其是兒童的身體健康構(gòu)成了嚴重威脅。在實踐工作中，我們就應(yīng)把重點轉(zhuǎn)向控制養(yǎng)魚環(huán)境這個環(huán)節(jié)上來，保護水質(zhì)，減少細菌的侵染途徑，才是防治魚病的根本。
一、材料與方法
1.病原菌的分離
采用普通蛋白瓊脂培養(yǎng)基，其成份為胰蛋白胨10g，酵母膏10g，氯化鈉5g，瓊脂18～20g，pH7.2～7.4，15磅20分鐘滅菌備用。
取患典型病癥的鰻魚，以無菌解剖刀將潰爛表層切開，以接種環(huán)迅速挑取少許病灶深層粘液，進行瓊脂平板劃線分離。28℃，24小時常規(guī)培養(yǎng)后，出現(xiàn)一些形態(tài)基本一致的菌落。挑取單菌落，進行純培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接斜面?zhèn)溆谩?nbsp;
2.致病性實驗
將實驗菌種接斜面，28℃培養(yǎng)約24小時，每個斜面中加入無菌生理鹽水5～10mL，制成濃厚菌懸液。取1mL菌懸液，以活菌平板計數(shù)法測定細菌數(shù)，吸取0.1mL菌懸液，注入健康鰻鱺腹腔中（注射前已置水族箱中觀察5天），同時設(shè)對照，置24～28℃水族箱中觀察其癥狀。
3.病原菌的形態(tài)觀察和生理生化實驗
采用致病力較強的菌株Ah3、Ah26、Ah38在28℃條件下，經(jīng)24小時培養(yǎng)，進行革蘭氏染色，鞭毛染色，觀察其形態(tài)及其它生理生化實驗。
4.血清型研究
1）采用小白兔（從市場上購買）制備抗血清。攻毒用健康鰻魚（由養(yǎng)鰻場提供），規(guī)格為40～50g左右，試驗前觀察5～7天證實健康無病。
2）將具有強致病力的Ah3、Ah26、Ah38等菌株分別于營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時，刮取菌苔，用無菌生理鹽水沖洗菌體三次，將菌體分別用0.35%福爾馬林滅活25小時，制得全菌抗原（WC抗原），4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?nbsp;
3）以0.35%福爾馬林滅活體0.1mL（濃度為1×10E9cell/mL）加等量弗氏完全佐劑混合均勻，皮下多點免疫白兔，以后每隔一周耳靜脈加強免疫，并逐次加大抗原劑量，獲滿意效價后頸動脈放血取血清。
4）試管凝聚法：免抗血清（1∶60）稀釋0.25mL，加入0.25mL濃度為15R/mL抗原，充分搖勻，4℃，12小時，觀察其凝聚反應(yīng)。
5.嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測定
Ah菌株接種營養(yǎng)肉湯，28℃培養(yǎng)24小時，測菌濃度，用無菌生理鹽水10倍系列稀釋菌體，腹腔注射健康鰻鱺，實驗水溫25℃，記錄死魚數(shù)及注射菌量，按Reed－Muench法計算LD50。
6.溶血活力測定
將Ah菌株純分離物接種于10%兔血平板，28℃培養(yǎng)過夜，以溶血圈直徑與菌落之比示溶血活力。
7.致病條件的探索性測定
采用致病力較強的Ah38號菌株為攻毒菌株，調(diào)整水族箱內(nèi)水體環(huán)境，使其含菌量大約為5～104cells/mL，在不同條件下，使健康鰻鱺浸浴其中，以觀察嗜水氣單胞菌的條件致病性。
二、實驗結(jié)果
1.本實驗共分離出菌株63株，其中經(jīng)人工感染具有致病力的菌株有8株，在這8株菌中，又有3株菌的致病力是極強的。
2.病原菌的形態(tài)觀察及生理生化特性。
本實驗結(jié)果表明，我們從病魚中就分離到的Ah3、Ah6、Ah7、An26、Ah31、Ah38、 Ah51、Ah53等菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特性及生理生化反應(yīng)基本一致，現(xiàn)以Ah38號菌株為代表簡述如下：
在營養(yǎng)瓊脂平板上，28℃，18～24小時培養(yǎng)菌落圓形、濕潤、表面光滑、低凸，邊緣整齊，半透明，乳白色，直徑1～1.5mm左右，有異味。在肉湯培養(yǎng)基中，28℃，18～24小時培養(yǎng)液均勻混濁，表面呈霧狀薄膜，一搖即散，在高倍顯微鏡下，呈兩端圓形的直桿菌，單個或成對，能運動，無芽胞，無莢膜，革蘭氏染色陰性，電鏡觀察有單生鞭毛。
根據(jù)這些培養(yǎng)特性，我們確認所分離到的菌株屬于嗜水氣單胞菌（Aeromonus hydrophila），它們是引發(fā)歐洲鰻暴發(fā)性傳染病的主要病原，這一點已得到了大多數(shù)學(xué)者的一致公認。
3.我們以致病力實驗中致病能力較強的Ah3、Ah26、Ah38號菌株制備兔抗血清，并與其它5株Ah菌株進行了試管凝聚試驗，結(jié)果表明，Ah3與Ah38屬同一血清型，Ah26屬另一血清型，其余5株分屬這兩個血清型，反應(yīng)專一性強，沒有發(fā)現(xiàn)能同時與兩種血清型反應(yīng)的菌株。
4.嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測定實驗結(jié)果向我們表明，八株Ah菌株對健康鰻鱺均有強的毒力，最強的Ah38號菌株，其LD50低于104CFU，同時，毒力強的菌株其菌溶血圈直徑與菌落直徑之比大于2，表明它有較強的溶血活力，其它LD50較低的菌株其溶血活力也較低。這個實驗結(jié)果啟示我們，嗜水氣單胞菌的毒力與其溶血活力有著一定的線性關(guān)系，不同血清型的菌株其溶血能力不一致，在我們的實驗中，以Ah38號菌株所代表的血清型有著更強的致病力，這為我們今后尋找防治嗜水氣單胞菌感染有效的用生物技術(shù)提供了一個新的思路。
5.嗜水氣單胞菌的條件致病性實驗結(jié)果表明，當(dāng)水體中含有一定量的嗜水氣單胞菌時，假如魚體健康水質(zhì)狀況良好，那么魚感染疾病的幾率是很小的；但當(dāng)魚體本身受到一定的損害時，比如說，腮絲破損或表皮破損，尤其是鰓絲受到損害時，魚則很容易受細菌感染而發(fā)病；而當(dāng)魚體受傷，水體環(huán)境亦差時，魚體的死亡速度和死亡率最高是不言自明的，正如我們的實驗所表示的那樣。
三、討論
嗜水氣單胞菌作為水中的固有菌群，由于它具有宿主范圍廣、感染力強等特點，而成為淡水魚類養(yǎng)殖業(yè)病害的主要病原之一。在實驗中所分離到的具有強致病力的Ah3、Ah26；Ah38號菌株分別代表著兩種不同的血清型，他們組成了引發(fā)江浙滬一帶淡水魚暴發(fā)性傳染病的主要病原；同時，毒力實驗和溶血活力實驗也表明，毒力強的菌株也有著較強的溶血活力。這似乎是嗜水氣單胞桿菌引起魚類大面積潰瘍出血的原因，這個結(jié)果與某些文獻報道結(jié)果基本一致。這些學(xué)者還認為嗜水氣單胞菌能引起魚體出血、溶血和死亡，其產(chǎn)生和溶血素、肉毒素和細胞毒素可能是致病因子有關(guān)。本實驗也表明，不同的菌株其毒性強弱是不同的。我們推測有的菌株只有一種毒性因子，有的則有多種，這與一些學(xué)者的某些觀點是一致的。
關(guān)于嗜水氣單胞菌的侵染途徑，我們初步推測是以腮為主要途徑，侵染后以肝臟為主要增殖部位，繼而再向全身彌漫性擴展，在本次實驗中，我們的致病菌株主要都由肝中分離得到，再感染后也以肝臟中出現(xiàn)病菌時間最早，說明嗜水氣單胞菌感染時還有一定的親嗜性。
氨氮亞硝酸鹽并不能為嗜水氣單胞菌的生長提供營養(yǎng)，但含量過高卻是導(dǎo)致魚類發(fā)病的重要環(huán)境因子。原因在于亞硝酸鹽氮能破壞機體血液的血紅蛋白，使紅血球失去攜氧能力，而氨氮除直接引起魚類中毒以外，還不斷分解產(chǎn)生亞硝酸鹽氮，從而使魚的抗病機能降低，容易受細菌的侵染而生病。在我們的實驗中，氨氮、亞硝酸鹽氮值僅為正常值的兩倍，鰻魚的死亡率即明顯高于對照組，也說明了這點。因此，我們初步認為，嗜水氣單胞菌作為引發(fā)淡水魚類暴發(fā)性傳染病的主要病原，屬于條件致病菌，它的傳染性與魚體的健康狀況和水體環(huán)境有關(guān)。近年來，大量涌現(xiàn)的文獻都報道，嗜水氣單胞菌的耐藥范圍和強度均在不斷拓廣和加強，且藥的殘留已對人類尤其是兒童的身體健康構(gòu)成了嚴重威脅。在實踐工作中，我們就應(yīng)把重點轉(zhuǎn)向控制養(yǎng)魚環(huán)境這個環(huán)節(jié)上來，保護水質(zhì)，減少細菌的侵染途徑，才是防治魚病的根本。
